当单色光通过液层厚度一定的含吸光物质的溶液后，一些光子被吸收，光强就从 I0 降到 I 。I和I0的比值用透光率T（transmittance）表示，T=I/I0。


透光率的负对数可用于表示入射光被吸收的程度，称为吸光度A(absorbance),即A =-lgT。从此式可以看出，物质的透光率越大，吸光度越小，对光的吸收越弱，反之对光的吸收越强。 


物质对单色光的吸收度A与吸光物质的溶液浓度c和液层厚度l的关系可以用朗伯-比尔定律描述。其中，朗伯定律解释了吸收度A与液层厚度l的关系，比尔定律解释了吸收度A与吸光物质的溶液浓度c的关系。 


朗伯-比尔定律（Lambert-Beer）是吸收光谱的基本定律(适用条件:稀溶液，单色光),它的数学表达式为: A = Ecl, E为吸收系数。此公式的物理意义是，当一束平行的单色光通过均匀的含有吸光物质的溶液后，溶液的吸光度A与吸光物质浓度c及吸收层厚度l成正比。 


吸收系数E是指一定波长下，吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度。在单色光、溶剂、温度等条件一定下，吸光系数是物质的特征常数，可作为定性分析的依据和定量分析灵敏度的估量。在一定条件下，物质的吸光系数越大，吸光能力越强。根据所采用的浓度单位，可以分为摩尔吸收系数ε和百分吸收系数。


 


1）摩尔吸收系数ε


摩尔吸收系数ε，单位为L/(mol*cm)，指在一定波长下，吸光物质溶液浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时的吸光度。实际工作时单位可省略不写。


摩尔吸收系数ε可分为强吸收、弱吸收和中强吸收。大于10000为强吸收，小于100为弱吸收，100~10000为中强吸收，摩尔吸收系数ε一般不大于100000。 


2）百分吸收系数


百分吸收系数又称为吸收系数，单位为100ml/(g*cm),指在一定波长下，吸光物质溶液浓度为1%（g*cm），液层厚度为1cm时的吸光度。百分吸收系数在药物测定中应用更广泛，《中国药典》均采用百分吸收系数，实际工作中单位也可省略不写。 


二、偏离比尔定律的因素


按照比尔定律，当入社单色光的波长、强度和溶液的液层厚度一定时，吸光度对溶液浓度所作的曲线应为一条过原点直线，但是在实际工作中，往往会偏离线性而发生弯曲。


曲线在实验中是否为直线取决于两个因素。一是比尔定律的前提条件：稀溶液。在溶液浓度大时（通常大于0.01mol/L），吸光质点的距离减小，彼此间的相互作用改变了它们吸收给定波长的辐射能力造成偏离直线。二是能否控制好影响吸光度测量的因素，主要是化学因素和光学因素两大类。


1）  化学因素（与样品有关）


①浓度较大时，吸光粒子距离减小，影响其电荷分布，使其吸收给定波长光的能力改变；


②溶液对光折射率有显著改变


③吸光物质有离解、缔合、光化作用、互变作用、或与溶剂的相互作用以及溶剂的影响。


由化学因素引起的Beer偏离，有时可通过控制溶液条件（如浓度，酸度，温度，时间等）设法减免 


2）光学因素（与仪器有关）


1）非单色光


比尔定律只适用于单色光。但紫外-可见分光光度计为了保证足够的光强度，使用的是具有一定谱带宽度的光源，必须要采用单色器把所需的波长从连续光谱中分离出来。分离的波长的宽度取决于单色器的狭缝宽度和棱镜或光栅的分辨率。由于技术的限制，狭缝宽度不可能无限的小，所以实际测定中入射光不可能绝对单色，因此入射光不仅含有所需波长的光，还会有附近波长的光。


入射光不纯：


①影响A与c的关系不成线性，即偏离比尔定律。


②严重影响物质的吸光系数值和吸收光谱形状（变形）。 


2）杂散光


杂散光指的是一些不在谱带宽度范围内的与所需波长相隔较远的光。 


①杂散光的来源：


仪器光学系统的缺陷，仪器保养不善，光学元件受尘染或霉蚀。


②影响：


杂散光可使吸收光谱变形，也会使吸光度值改变。但现代仪器杂散光的影响可以忽略不计。 


3）散射光和反射光


入射光通过吸收池内外界面时，界面可产生反射作用；入射光通过测试液时，会产生散射作用。因此测量A值时，光强度的减弱并不完全是吸光物质的吸收，还有：


①溶剂、容器的吸收


②吸光质点，溶剂分子的散射


③吸收池内、外界面的反射


可通过空白对比进行补偿以抵消反射作用和散射作用的影响。 


4）非平行光


如果以一定角度倾斜光通过吸收池，非平行光的实际光程会比垂直照射时的平行光光程增大，导致偏离朗伯-比尔定律，使A值偏高。故吸收池不得倾斜放置光路中。